Por: Nancy Shellhorn, HT (ASCP), Tracy Majewicz, MB (ASCP), HTL (ASCP), Fayrouz Manadilo, MB (ASCP), HTL (ASCP)
O FISH é uma técnica que utiliza uma sonda marcada com fluorescência que se liga a uma sequência de DNA complementar com um alto nível de especificidade para células da metáfase ou da interfase. A dupla hélice do DNA é separada (desnaturada) por calor e produtos químicos e reformada (hibridizada) com a sonda alvo (O'Connor, 2008). As sondas fluorescentes (moléculas que absorvem luz de um comprimento de onda específico e emitem luz de um comprimento de onda diferente, tipicamente mais longo [um processo conhecido como fluorescência]) podem ser cadeias de DNA ou RNA. Utilizamos DNA (uma hélice dupla formada a partir de duas cadeias complementares de nucleotídeos mantidas juntas por ligações de hidrogênio entre os pares de bases GC e AT). A duplicação dessas informações genéticas ocorre pelo uso de uma fita de DNA usada como modelo para a formação de uma fita complementar.
O FISH é usado para detectar anormalidades cromossômicas, incluindo deleções, duplicações e translocações; é um teste importante que fornece informações para o diagnóstico e prognóstico patológico de várias doenças. Nosso departamento de histologia recebeu o encargo de desenvolver um laboratório de FISH com base nas regras e regulamentos estaduais para laboratórios clínicos na Flórida, o que denota especificamente que um histotecnólogo lida com amostras de tecido embebidas em parafina. Começamos desenvolvendo o teste complementar da sonda Her2 FISH para que pudéssemos diminuir o tempo de resposta para relatar casos que precisavam ser submetidos a testes adicionais se forem diagnosticados como positivos para HER2 por imunohistoquímica (IHC) com pontuação 2+. O teste HER2 (IHC), se diagnosticado como 2+ pelas diretrizes da Sociedade Americana de Oncologia Clínica (ASCO), também é necessário que o teste FISH HER2 seja feito na amostra, bem como o teste Her2 pela IHC. Em nosso laboratório FISH, desenvolvemos o teste FISH HER2 com um kit FISH aprovado pela Agência Federal de Medicamentos (FDA) especificamente para testes Her2.
Ao desenvolver o laboratório, a primeira coisa que precisávamos realizar foi garantir que o pessoal do laboratório FISH estivesse licenciado na Florida em Molecular Biology para estar em conformidade com as regras e regulamentos. O exame atual é realizado pela ASAP / BOC. Aprendemos desnaturação, hibridação, rigor, hibridação cruzada, o papel do tempo e da temperatura, lavagem do sinal não ligado, intensidade e padrão do sinal, o efeito de diferentes tipos de óleo de imersão, solução de problemas e requisitos de qualidade.
O próximo passo foi a validação do teste. Isso é para determinar a especificidade, sensibilidade, precisão e reprodutibilidade da sonda. Com a consulta de um patologista, estabelecemos critérios de pontuação claramente definidos para determinar se o teste era aceitável. Isso incluiu casos ambíguos e aqueles em que os técnicos não estavam de acordo. A validação do teste também confirma o corte e a interpretação do teste para atender às diretrizes do College of American Pathologists (CAP) / ASCO. Inicialmente, iniciamos a validação usando as Diretrizes CAP / ASCO de 2007, que foram atualizadas posteriormente em 2013; agora aderimos às diretrizes CAP / ASCO de 2018 mais atuais (Wolff et al., 2018). Ao estabelecer nossos parâmetros de teste, recrutamos um técnico médico certificado para concluir a parte específica da validação. O tecnólogo precisava ser certificado em ler cariótipos em células metafásicas. A pontuação da metafase ainda é considerada o “padrão ouro” para estabelecer o padrão de sinal esperado no local cromossômico correto (Gu, Smith & Dowling, 2017).
Uma das tarefas mais desafiadoras que enfrentamos foi aprender a enumerar ou contar indicadores significativos no ensaio. Até agora, a contagem manual de sinais por célula ainda é a abordagem padrão, tornando a análise de dados a etapa de limitação de taxa pós-experimental. As decisões de diagnóstico geralmente são baseadas na proporção do número de sinais de duas regiões cromossômicas distintas para determinar a amplificação cromossômica ou genética (Huber, Voith von Voithenberg e Kaigala, 2018). Nossos tecnólogos viajaram para os Laboratórios Abbott em Chicago, Illinois, para treinamento. Os tópicos de treinamento cobriram a formação técnica do FISH, o processamento das amostras de tecido e as enumerações das amostras usando o microscópio fluorescente (Abbott Laboratories, 2010). Foi realizado um estudo de comparação que incluiu quarenta amostras de tecido positivas e quarenta negativas para dois histotecnologistas enumerarem. Os resultados foram comparados com outros laboratórios que oferecem o teste após a análise de amostras paralelas e a investigação de quaisquer resultados discrepantes. Os histotecnologistas tiveram que distinguir diferentes representações de sinais e adquirir as habilidades necessárias para determinar tumor vs. não tumoral e in situ vs. invasivo. Eles também tiveram que aprender a determinar com precisão o número de sinais em cada célula (Wolff et al abril de 2007). A razão entre o alvo (vermelho) e o controle (verde) em um total de 60 células, além do número médio de cópias de sinais Her2 por célula, foi usada para determinar os resultados positivos ou negativos dos testes (Gu et al., 2017 ) Os resultados foram comparados com outros laboratórios que oferecem o teste após a análise de amostras paralelas e a investigação de quaisquer resultados discrepantes. Os histotecnologistas tiveram que distinguir diferentes representações de sinais e adquirir as habilidades necessárias para determinar tumor vs. não tumoral e in situ vs. invasivo. Eles também tiveram que aprender a determinar com precisão o número de sinais em cada célula (Wolff et al abril de 2007). A razão entre o alvo (vermelho) e o controle (verde) em um total de 60 células, além do número médio de cópias de sinais Her2 por célula, foi usada para determinar os resultados positivos ou negativos dos testes (Gu et al., 2017 ) Os resultados foram comparados com outros laboratórios que oferecem o teste após a análise de amostras paralelas e a investigação de quaisquer resultados discrepantes. Os histotecnologistas tiveram que distinguir diferentes representações de sinais e adquirir as habilidades necessárias para determinar tumor vs. não tumoral e in situ vs. invasivo. Eles também tiveram que aprender a determinar com precisão o número de sinais em cada célula (Wolff et al abril de 2007). A razão entre o alvo (vermelho) e o controle (verde) em um total de 60 células, além do número médio de cópias de sinais Her2 por célula, foi usada para determinar os resultados positivos ou negativos dos testes (Gu et al., 2017 ) não tumoral e in situ vs. invasivo. Eles também tiveram que aprender a determinar com precisão o número de sinais em cada célula (Wolff et al abril de 2007). A razão entre o alvo (vermelho) e o controle (verde) em um total de 60 células, além do número médio de cópias de sinais Her2 por célula, foi usada para determinar os resultados positivos ou negativos dos testes (Gu et al., 2017 ) não tumoral e in situ vs. invasivo. Eles também tiveram que aprender a determinar com precisão o número de sinais em cada célula (Wolff et al abril de 2007). A razão entre o alvo (vermelho) e o controle (verde) em um total de 60 células, além do número médio de cópias de sinais Her2 por célula, foi usada para determinar os resultados positivos ou negativos dos testes (Gu et al., 2017 )
O relatório apresentava vários requisitos estabelecidos pela PAC, incluindo o tempo fixado em formalina para amostras de tecido mamário, seleção de kits e fornecedores, informações sobre como o teste foi validado, incluindo testes modificados pela FDA / FDA ou desenvolvidos pelo laboratório, treinamento da equipe, procedimentos operacionais, formulários, listas de verificação e criação de relatórios. Essas tarefas precisavam ser executadas antes que o teste pudesse ser implementado (Gu et al., 2017). O fluxo de trabalho relacionado à forma como os resultados seriam revisados pelo patologista, assinado e relatado também se tornou um desafio.
Uma vez que o teste estava em funcionamento, tivemos que abordar os regulamentos da CLIA, que exigem análise das características de desempenho de cada teste de FISH para avaliar problemas relacionados ao teste. Estabelecemos uma resolução para esse requisito, garantindo um exame semestral de proficiência em CAP para o FISH Her2. O teste de proficiência é denominado “CYH” e é usado para verificar se a equipe é proficiente na enumeração das amostras. Existem dez amostras de tecido fornecidas pelo CAP. O laboratório deve investigar e enumerar cada amostra e passar com uma concordância de 90%.
Estamos avançando para incorporar uma ampla gama de testes de FISH e, à medida que crescemos, chegamos à conclusão de que precisamos de um PhD molecular experiente para nos levar ao futuro. Estamos empolgados com os novos testes de FISH que temos atualmente em andamento e esperamos expandir nossas habilidades de teste para ajudar melhor no diagnóstico de nossos pacientes.
Caso negativo Her2
Caso positivo Her2
Referências
Laboratórios Abbott. (2010). PathVysion, o teste HER2 para mulheres com câncer de mama. Guia de Treinamento do Cliente Lista No. 02N18-02.
Gu, J., Smith, JL & Dowling, PK (2017). Validação da sonda de hibridação in situ por fluorescência para uso clínico. Citogenética do Câncer : Métodos e Protocolos, Métodos em Biologia Molecular , 1541 . DOI 10.1007 / 978-1-4939-6703-2_10.
O'Connor, C. (2008). Hibridização fluorescente in situ (FISH). Cromossomos e citogenética. https://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327/
Huber, D., Voith von Voithenberg, L., & Kaigala, GV (2018). Hibridização fluorescente in situ (FISH): história, limitações e o que esperar do FISH em escala micro? Micro e Nano Engineering, 1, 15-24 . https://doi.org/10.1016/j.mne.2018.10.006
Wolff, Antonio C., Hammond, Elizabeth Hale, Allison, Kimberly H., Harvey, Brittany E., Mangu, Pamela B. (2018). Teste do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano no câncer de mama. Arquivos de Patologia e Medicina Laboratorial.
Wolff, DJ, Bagg, A., Cooley, LD, Dewald, GW, Hirsch, BA, e Jacky, PB (2007). Orientação para testes de hibridação fluorescente in situ em distúrbios hematológicos. Jornal de Diagnóstico Molecular, 9 (2).
Fonte: Traduzido de https://www.fixationonhistology.com/post/fluorescent-in-situ-hybridization-fish